扭扭车厂家
免费服务热线

Free service

hotline

010-00000000
扭扭车厂家
热门搜索:
产品介绍
当前位置:首页 > 产品介绍

突破腺相关病毒载体包装容量限制的策略二园林石雕调压器望远镜螺帽集电环Frc

发布时间:2023-12-18 22:53:29 阅读: 来源:扭扭车厂家
突破腺相关病毒载体包装容量限制的策略二园林石雕调压器望远镜螺帽集电环Frc

突破腺相关病毒载体包装容量限制的策略(二)

在rAAV 形成多聚体时重新组装

AAV 的基因组由两个病毒反向重复序列( ITR ) 和置于其间的rev、cap 基因组成, 在感染细胞后,AAV 之间通过ITR 互相连接形成多聚体。在rAAV 载体中, ITR 间的rev、cap 基因被基因治疗的目的基因所取代, rAAV 载体也仍然可以形成多聚体, 而且这种多聚体形成也是以附着体形式存在的目的基因长期表达的机制之一8 。

利用rAAV 载体形成多聚体这一特性, 可以有效地扩大rAAV 的包装容量。Duan 等9 将SV 40 和CMV 增强子置于一个rAAV 载体(AV. SupEnh) , 将其与仅含报告基因的rAAV 载体共转染细胞(AV. L uc) , 报告基因的表达水平是同时含相应调控元件与目的基因的rAAV 载体[AV. SV (P?SupEnh)L uc ]的10% , 如果在报告基因载体上加上一个异源启动子[SV 40,AV. SV (P)L uc , 则表达水平可上升到50%。将同样的载体转染C57BL 小鼠骨骼肌后, 报告基因的表达水平分别较仅转染AV. L uc 、AV. SV (P)L uc 载体者高600 倍和2耐氯性和抗紫外线性能极强00 倍。该研究结果还提示ITR 可能有潜在的启动子活性。虽然rA两夹具以1定的速度分离并拉伸试样AV 载体已经丧失了定点整合的能力, 但是仍可能有少量的载体基因整合到宿主基因组中去, 由于CMV 增强子和SV 40 增强子均没有组织特异性和启动子特异性, 而且ITR 序列所具有的潜在启动子和增强子活性, 使其不能作为防止增强子作用扩散的隔离子的作用, 所以当含这两种增强子的rAAV 载体与宿主基因组发生整合, 则可能导致临近的基因活化, 如果所活化的基因是癌基因, 则有致癌的危险性, 因此需要对这种将调控元件与目的基因分别表达的策略做进一步的改进, 方能真正具有实用周口价值。选择基因组中所存在少量的启动子与组织特异性的增强子可能是解决这一问题的途径之一, 这些增强子的作用可以被隔离子( Insulato r) 所阻断, 其仅在特异的蛋白因子的协助下, 作用于与之匹配的启动子, 促进基因表达10 。同时在rAAV 载体构建时, 在增强子与ITR 之间放置隔离子,这样似乎可以避免由于基因整合所带来的致癌危险。共转染的rAAV 载体间通过反式剪切重组出完整目的基因是利用rAAV 载体成多聚体这一特性扩大其包装容量的另一策略。N akai H 等人11 在含无启动子的报告基因的rAAV 载体(AAV 2P less2nlsL acZ) 和含EF1a 启动子的rAAV 载体(AAV 2EF1aEP) 上分别加装一段保留有剪切位点的内含子序列, 将其同时经肝注射后, 在共同转染有这两种rAAV 载体肝细胞中, 形成多聚体的rAAV 载体串联形成完整的表达框架, 转录产物通过反式剪切将RNA 中的内含子及ITR 剪切去除, 从而获得了报告基因的正确表达, 但报告基因的表达水平仅为对照(同时含有调控元件与目的基因的rAAV 载体) 的2. 9%。但是当共转染有含两个头头相连(head2to2head) 的EF1a 启动子的rAAV 载体[AAV 2(EF1aEP) 2 后, 表达水平可以升高到对照的60%~ 70% , 其机制可能与这两个启动子在rAAV 载体形成多聚体后对其两侧所连接的目的基因转录启动和?或顺式增强作用有关。

基于相似的原理, Yang ZY 等12 将EPO 基因分成两个部分, 并分别在其尾端和头端附加上EPO 基因3 号但这家单位采取的是国外进口的氧化铝内含子的部分序列及剪切位点后置于两个rAAV 载体中,以总共6×106 的剂量将两种载体肌肉注射的肾衰贫血模型中获得了治疗水平的EPO 表达。Chao H 13 等将因子DcDNA 表达盒分成两个部分, 1~ 12 号外显子与肝特异性启动子锌及锌锭(L SP) 或CMV 启动子置于一个rAAV 载体, 而剩余的外显子与po lyA 置于另一个rAAV 载体, 在两个载体的尾端和头端分别附加一段含剪切位点的内含子序列, 在共同转染细胞后可获得120mU?m l 的表达, 肝门注射小鼠后, 因子D 表达水平可达到正常2% , 持续时间4月。

上述策略虽然取得了一定的成绩, 但也存在明显的局限性。由于目的基因的表达框架分别置于两个载体中,单独的载体均不能有效灯箱布表达, 而且反式剪切要求rAAV载体多聚体形成的过程中必须有正确的方向, 即头尾相连, 虽然在Chao H 的研究中认为头2尾相连是主要的多聚体形成方式, 但是在N akai H 等也提到了其他形式如头2头, 尾2尾, 尾2头等连接方式在体内也可能是存在的。因此通过反式剪切扩大rAAV 载体包装容量的策略效率并不是最理想。Duan D 等人14 利用反式剪切机理将B2gal 基因作为报告基因分别构建于不同的rAAV 载体中,在小鼠肌肉中仅获得了具有完整表达框架的rAAV 载体的4. 3%的表达水平, 也说明反式剪切的较低的表达效率是阻碍其应用的主要障碍。

不同rAAV 载体间同源重组

具有相同DNA 序列的基因片段可能在细胞内发生同源重组而形成完整的基因, 而且同源序列间重组的效率在超过一定的长度之后, 与同源序列间重叠长短无关。Halber C15等人将碱性磷酸酶基因(A P) 分成两个部分表达于rAAV 载体之中, 两个载体中的基因序列有440~1000 个碱基的重叠, 共转染细胞后, 无同源序列的载体不产生A P, 而有同源序列的产生A P, 且产生的效率与剂量相关, 与同源序列的长短无关。此研究结果提示通过基因片段间的同源重组可能作为扩大rAAV 载体包装容量的途径之一。但相关研究提示, 在以B2gal 为报告基因时皮夹, 通过同源重组在细胞内表达的基因的水平仅为含完整表达框架的载体的0. 37%14 。因此, 可能同源重组仅在部分组织或针对部分基因有效。

综上所述, 通过对AAV 生物学特点及目的基因结构特点的认识, 及基因表达调控研究的深入, 采取恰当的策略扩大rAAV 载体的包装容量以扩大其应用范围已成为可能, 实验研究也已取得较大的进展, 但距临床应用还有不小的距离, 还需进行大量的实验与临床研究以解决其中的困难。

作者/上海第二医科大学瑞金医院上海血液学研究所

武文漫 综述 王鸿利 沈志祥 审校

小孩为什么会得鼻窦炎
孩子咳嗽有痰怎么办
儿童鼻窦炎能自愈吗
儿童上呼吸道感染吃什么药